自体肝移植的临床和相关实验研究

【摘要】目的：1)探讨离体全肝切除和自体肝移植术(Ex-vivoliverresectionandautotransplantation,ELRA)治疗晚期肝脏泡球蚴病(Alveolarechinococcosis,AE)的适应症,可行性,安全性和有效性；评价三维重建影像评估系统与个体化虚拟手术的临床意义；初步探讨ELRA术后移植物增生的规律；评价ELRA术经济和社会效益；2)建立Wistar大鼠极限肝切除模型,评价极限肝切除术后的肝再生和存活率；3)建立Wistar大鼠慢性肝损伤模型,探讨骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSCs)和慢性肝纤维化肝再生修复的关系及可能机制；4)探讨TLR3通路与BMSCs在慢性肝纤维化中的相互作用和与肝纤维化肝再生修复的可能机制。方法：第一部分：1)总结2010年8月至2013年08月按纳入标准实施的10例ELRA术治疗晚期肝AE患者的临床资料,分析临床资料,探讨临床适应症；2)通过术前CT与三维肝脏重建软件测量数据和手术探查所见与移植物实际质量结果分析,分析个体化虚拟手术设计的准确性和可行性。3)通过患者术中情况、并发症和住院总费用等临床资料,分析手术可行性和安全性。4)术后CT随访1,3和6月移植肝体积(GV)和受体标准肝体积(SLV)比,结合术后PET/CT检查结果,分析半年内肝脏增生变化。第二部分：对Wistar大鼠分别行70%、80%、90%肝体积极限切除,统计术后各组大鼠的存活率,并检测外周血清中ALT及AST浓度,对比术后14天存活大鼠肝脏质量。HE染色观察三组肝脏组织形态学变化。第三部分：取雄性大鼠股骨和胫骨骨髓,提取、分离培养、纯化、扩增BMSCs,使用光学显微镜观察BMSCs的形态,用免疫组织化学(IHC)检测BMSCs表面CD31、CD45、CD44、CD105、CDllb、CD29的表达阳性率。用二乙基亚硝胺(DEN)配成0.01%浓度饮用水供雌性大鼠饮用16周换正常水,建立慢性肝损伤模型,第4、8、12、16周经尾静脉输注1×106个BMSCs,并设置单纯造模组及空白对照组；20周核磁共振(MRI)检查大鼠肝脏；21周处死大鼠,HE染色观察肝脏组织形态变化：原位杂交技术检测大鼠肝脏SrY表达；VG染色观察肝脏中胶原纤维量；IHC检测α-SMA、LR3;Western-blotting检测肝脏α-SMA、TLR3、TRIF、NF-kBp65、IRF3表达,FQ-RT-PCR检测TLR3、IRF3mRNA表达。结果：第一部分：1)10例移植物均存活,符合纳入标准时手术安全性较高。2)术中探查与移植物体积和术前CT与肝脏三维重建结果一致,10例患者GV/SLV在41%-78%之间,平均60.6%,其中9例患者虚拟切除移植物体积695.11±142.14cm3,实际余肝脏体积687.78±130.81cm3(P>0.05)；3)术中1例经脐静脉低温灌注外,余9例经门静脉灌注；2例无肝期下腔静脉未重建,3例行自体下腔静脉重建,5例人造血管暂时性门腔分流；手术11.5～20.5h,平均15.2h,无肝期200-435min,中位时间285.5min,术中输注红细胞悬液0～15u,术后住院时间21～58d,总并发症发生率6例(60%)；住院总费用10.16～43.48万元,中位费用17.44万元；4)CT测术后第1月移植物体积平均增加14.75%；术后2～3月平均每月增加3.75%；术后4～6月平均每月增加3.08%；术后半年移植物/标准肝体积比平均87.5%；PET/CT测18氟-脱氧葡萄糖(18F-FDG)的平均标准摄取率(SUVave)0.9～1.9;随访时间2～37个月,1例术后6个月死亡,最长存活时间27个月。第二部分：1)大鼠肝切术后6h开始出现死亡,术后8-12h为死亡高峰,70%、80%、90%肝体积切除组2周存活率分别为86.7%、80%、7%。2)80%及90%肝体积切除组术后8h、12h时血清ALT、AST浓度比70%组显著增高(P<0.05),而80%与90%组之间无差异(P>0.05)；80%组术后24h、3天时血清ALT及AST浓度比70%肝体积切除组高(P<0.05)；术后7天左右各组ALT及AST浓度基本恢复正常。3)术后14天80%组剩余肝体积明显大于70%肝体积切除组(P<0.05)。4)三组肝脏组织形态无明显异常。第三部分：1)P3代BMSCs细胞表面的CD31、CD45、CD44、CD105、CDllb、CD29的阳性率分别为(12.0%、8%、1.2%、62.2%、1.5%、16.7%)；2)原位杂交技术检测示仅有BMSCs移植组表达SrY。3)核磁共振结果示BMSCs移植组肝脏上结节数量比单纯造模组多(P<0.05)；4)HE染色显示单纯造模组8只轻度肝纤维化形成；BMSC移植组中9只形成明显的肝纤维化,1只形成肝癌；空白对照组无肝纤维化形成。5)免疫组化显示BMSCs移植组比单纯造模组α-SMA阳性表达率高(P<0.05)；空白对照组无表达。TLR3主要表达于肝细胞包浆中；6)VG染色BMSCs移植组胶原区的百分比数比单纯造模组高(P<0.05)。7)westernblotting结果显示BMSCs移植组比单纯造模组α-SMA蛋白水平高(P<0.05),BMSCs移植组肝脏中TLR3、NF-kBp65、IRF3蛋白水平及TLR3、IRF3mRNA表达比空白对照组和单纯造模组都高(P均<0.05),单纯造模组稍高于空白对照组(P<0.05)；而TRIF蛋白表达水平在三组间无明显差异(P>0.05)。结论：1)对于外科原位手术切除极为困难或侵及下腔静脉无法切除的晚期肝AE可以通过ELRA术治疗,适应症为本研究纳入标准；CT和三维肝脏重建软件能够在术前准确评估肝脏病灶与主要管道关系,评价病灶侵犯程度和预测移植物体积,提高手术安全性；在无肝期个体化处理进行自体或人造血管腔静脉暂时性门体分流技术,下腔静脉重建技术和离体肝切除血管重建技术等综合应用安全、有效；术后移植肝再生主要发生在移植术后半年内,尤其是术后第1个月,术后2～6月逐渐放缓,半年后基本接近患者标准肝体积；ELRA术治疗晚期肝AE有良好的经济社会效益和独特的应用前景,有助于在国内外推广应用；2)大鼠肝切除量在80%以下是安全的,提示对于正常成人极限肝切体积有可能超越70%；且肝脏切除量越大,其增生体积越多；3)BMSCs在DEN所致的慢性肝损伤模型中具有促进肝纤维化的作用,并有致肝癌的可能；4)TLR3通路上的相关蛋白可能参与了慢性肝损伤肝再生修复过程,BMSCs在TLR3通路激活的微环境中可能倾向于分化为肝星状细胞、肌成纤维细胞,TLR3与BMSCs之间相互影响,并相互作用于对方,最终导致慢性肝损伤后肝纤维化形成。
【作者】邰沁文；
【导师】温浩；
【作者基本信息】新疆医科大学，外科学，2013，博士
【关键词】自体肝移植；泡球蚴；极限肝切；肝再生修复；骨髓间充质干细胞；TLR3；

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